云南南部5种魔芋属植物居群遗传结构的ISSR分析
时间: 2015-07-04 16:34:39 来源: 2013年武汉大学学报第1期第59卷
云南南部5种魔芋属植物居群遗传结构的ISSR分析
任盘宇1 潘明清2
（1 中国科学院西双版纳热带植物园 云南西双版纳 666303；
2 武汉大学生命科学学院 湖北武汉 430072）
摘 要：采用9个ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记对云南南部魔芋属植物5个物种（花魔芋，疣柄魔芋，攸乐魔芋，勐海魔芋和屏边魔芋）105份材料进行了居群遗传多样性分析，通过PCR扩增，9个ISSR引物从5个物种105份样品中共获得95条条带，其中多态性条带占条带总数的100%，每个位点平均等位基因数2.00，有效等位基因数1.4，平均Nei’S基因多样性指数0.2552，Shannon’s信息多样性指数为0.4012，在这5个魔芋属植物物种中，花魔芋居群内遗传多样性水平相对较低，居群水平上的UPGMA聚类表明这5个物种可被分为明显的两大组，花魔芋为一组，其余4种构成一组，其中屏边魔芋与疣柄魔芋遗传距离最近，个体水平上的聚类则显示，花魔芋和疣柄魔芋的个体各自聚在一起，其余3种的个体较为分散。本研究结果还认为人工栽培利用的方式对魔芋属植物遗传多样性可能存在一定影响。
关键词：魔芋属；ISSR；遗传多样性；云南省
中图分类号：Q 979.7 文献标识码：A
0 引 言
魔芋属（Amorphophallus）隶属于单子叶植物天南星科，是多年生草本植物。该属植物分布的西界为西非，波利尼西亚一线；南至印度尼西亚，加里曼丹一带；北至北纬35°的中国陕西，甘肃一带；东界直至日本，菲律宾，新几内亚一线。在魔芋属植物的163个物种中共有21种分布于中国，其中9种为特有种[1,2]。由于该属植物是迄今发现的惟一能够大量合成广泛运用于医药及工业等领域的葡甘露聚糖（glucomannan）的作物，因此近年来对于魔芋属植物的研究已经成为广受关注的热点。在魔芋属植物中，花魔芋因其高产量与高葡甘露聚糖含量成为中国种植最为广泛的魔芋种类；疣柄魔芋则是印度种植最为广泛的魔芋种类，主要用于动物饲料，在中国有分布但无种植；攸乐魔芋和勐海魔芋均为可食用魔芋种类，但均无栽培记录；屏边魔芋目前未被收入《中国植物志》。
近10年分子标记及测序等手段已被引入到魔芋属植物种质资源的鉴定工作中，如：张玉进等[3]对中国的22份魔芋资源材料进行RAPD（polymerasechain reaction）分析，将材料分为6类，并构建了亲缘关系；Grob 等[4]利用FLO／LFY （FLORICAULA／LEAFY）第二个内含子序列对46种魔芋属植物资源进行了亲缘关系分析，并构建了系统进化树；滕彩珠等[5,6]利用AFLP（amplified fragmentlength polymorphism）技术与ISSR（inter-simple sequencerepeat）技术对魔芋属植物种质资源进行多态性分析；张盛林等[7]应用RAPD分子标记技术对34份白魔芋种质资源进行分析了分析；宣慢[8]采用ISSR分子标记技术对49份魔芋属种质资源进行了遗传多样性分析。这些研究为认识魔芋属植物的分类及种质资源的遗传多样性水平提供了资料，已有研究利用细胞学特征，植物生活习性及染色体特征等方面的研究结果论证了魔芋属可能起源于中国云南南部与中南半岛地区[9]，因此，研究中国云南南部地区魔芋属植物遗传多样性及其遗传结构对于全面理解该属植物的系统发育及资源可持续利用具有重要意义。
本研究利用ISSR分子标记，对云南地区野生魔芋属植物5个物种进行遗传多样性分析，检测这5个不同种之间的遗传多样性差异，同时研究了人工栽培对魔芋属植物资源遗传多样性的影响，探讨了这5种魔芋属植物种间关系，并对未载人《中国植物志》的物种——屏边魔芋进行系统学地位初步评估，确定其近缘种。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用材料来自于云南南部地区，包括5个物种（花魔芋，疣柄魔芋，攸乐魔芋，勐海魔芋，屏边魔芋）105个植株的样本．每个物种的样本取自一个居群，每一居群分别取6-32份个体（表1）。对每一个体，取约5g新鲜幼嫩的叶片用硅胶快速干燥保存，带回实验室用于提取基因组DNA。
表1 所研究物种的分布及本研究所取材料的来源
1.2 实验方法
基因组DNA 的提取参照CTAB法[10]。
实验所选引物从UBC（英国哥伦比亚大学）提供的引物序列中筛选得到，共选取9个引物（由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成）：811，823，834，861，862，866，873，8809，889，其序列见表2。
PCR扩增反应在LiftPro PCR仪（杭州博日科技有限公司）上进行，反应总体系为25µL，其中DNA模板10ng，10×buffer 2.5µL ，2.5mmol／LdNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）2.5µL，1.5mmol／LMgC12 1.5µL，TagDNA聚合酶（5U／µL）0.2µL，引物（10pmol／L）µL，加蒸馏水至25µL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；然后进入扩增循环，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共40个循环；最后在72℃延伸10min，于4℃保存．电泳缓冲液为1×TAE（Tris-乙酸），90 V 电压下电泳1h，电泳结束后在紫外灯下观察照相，统计结果。
1.3 数据处理
记录各材料各引物扩增结果：有带记为“1”，无带记为“0”，作0，1矩阵图输入计算机，利用POP-GEN32软件计算：实际等位基因数Na；：平均有效等位基因数Ne；Nei’S（1973）基因多样性指数H；Shannon’S信息多样性指数I，并采用NTSYS-pc（Version2.1）软件应用平均距离法（UPGMA）对材料在居群水平上与个体水平上分别进行了聚类分析，建立聚类图。
2 结 果
2.1 ISSR扩增结果
利用9个ISSR引物共获得95条清晰的可重复条带，其中多态性条带95条，占总条带数的100％，图1为引物UBC811对花魔芋与部分疣柄魔芋样本的扩增效果。
2.2 遗传多样性指标
各居群内遗传多样性相关数据见表3。5种魔芋的多样性水平从高到低依次为屏边魔芋，攸乐魔芋，疣柄魔芋，勐海魔芋，花魔芋，其中屏边魔芋拥有最高的遗传多样性水平（H=0.2526，I-0.3940）；而花魔芋遗传多样性水平最低（H=0.1340，I-0.2038），对105份样本数据进行统计分析，其中，Na=2.00，Ne=1.40。
2.3 居群间遗传距离与遗传相似度
5个魔芋属植物居群间Nei’s（1978）遗传距离与遗传相似度见表4。
其中，群体间相似度为0.9666-0.8884，最大遗传相似度出现在攸乐魔芋与疣柄魔芋之间，其相似度为0.9666；遗传距离为0.1924-0.0574最大遗传距离出现在攸乐魔芋与勐海魔芋之间，其距离为0.1924。
2.4 居群水平的聚类分析
根据扩增结果利用Nei’s（1978）遗传距离进行聚类分析，5个群体被分为两组，其中花魔芋自成一组，疣柄魔芋，攸乐魔芋，勐海魔芋与屏边魔芋组成一组，5个物种的魔芋资源聚类图见图2。
2.5 个体水平上的聚类分析
对105份材料的MP（maximum parsimony）聚类图见图3。
分析结果表明：样品间Jaccard相似性系数为0.8571- 0.0546，样品间SM 相似性系数为0.947 4-0.4737；其中花魔芋样品之间较好地聚类到一起；疣柄魔芋样品之间也较好地聚类到一起，而其他3个物种的个体在聚类图（见图3）上的分布则较为分散。
3 讨 论
总体而言，不同种类的魔芋属样品间均表现出较高的遗传相似度差异．本研究根据对全部105份样本的数据进行计算得到样品间Jaceard相似性系数为0.8571-0.0546，样品间SM 相似性系数（simple matching coefficient）为0.9474-0.4737，遗传多样性高于此前的研究结果。滕彩珠等[6]利用ISSR技术对魔芋属植物种质资源进行多态性分析，30份的样本中（包括6份野生资源及24份栽培材料：花魔芋16份，白魔芋5份，西盟魔芋1份，甜魔芋1份，珠芽魔芋1份）Jaccard相似性系数为0.95-0.65。宣慢[8]采用ISSR技术对49份魔芋属资源的多样性分析，其SM相似性系数为1.00-0.68。
出现较高遗传相似度的原因可能有：
① 此前研究中采用的多为栽培材料，而一般栽培材料多采用无性繁殖方式繁殖，这可能导致较高遗传相似度；而本实验采用野生材料，在自然环境下无性繁殖的同时兼有异花授粉方式的有性繁殖。
② 本研究中的分析对象既包括经济价值的葡甘露聚糖利用型魔芋种（花魔芋）和淀粉利用型魔芋种（疣柄魔芋），又包括非经济利用型的魔芋种，选材更为宽泛。
③ 研究材料来源于被认为是天南星科植物起源中心的云南地区。
对5个物种的居群遗传多样性平行比较发现，花魔芋具有最低的遗传多样性。与其他魔芋属植物比较，花魔芋作为葡甘露聚糖利用型魔芋在中国得到大规模种植与利用，人工种植与对野生资源的采挖可能导致了花魔芋野生居群具有较低水平的遗传多样性，作为目前利用最为广泛的魔芋种，资源多样性保护直接关系到该物种的开发潜力与利用价值，因此，进一步评估花魔芋遗传多样性水平，提出该物种可行的保护策略迫在眉睫。
种间聚类分析发现其中花魔芋自成一组，疣柄魔芋，攸乐魔芋，勐海魔芋与屏边魔芋构成一组，另外，屏边魔芋与疣柄魔芋，攸乐魔芋，勐海魔芋具有较高相似度，其中与疣柄魔芋相似度最高（Nei’s（1978）遗传相似性为0.9552）。该结果说明屏边魔芋遗传学上可能与疣柄魔芋较近，可能偏向于淀粉利用型。除花魔芋和疣柄魔芋样品间分别较好地聚在一起，其他3个物种的样品则较为离散，虽然基于ISSR分子标记的研究尚不足以对魔芋属物种划分和种间关系作出判定，但可以为魔芋属的系统学研究提供可参考的资料。
参考文献：
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[3] 张玉进，张兴国，刘佩瑛，等．魔芋种质资源的RAPD分析[J]．西南农业大学学报，2001，23（5）：418-421
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[5] 滕彩珠，刁英，易继碧，等．魔芋种质资源的AFLP分析[J]．氨基酸和生物资源，2006，28（4）：33-35
[6] 滕彩珠，刁英，常福浩森，等．云南魔芋种质资源亲缘关系的ISSR分析[J]．安徽农学通报，2006，12（11）：54-56
[7] 张盛林，孙远航．自魔芋种质资源的RAPD分析[J]．中国农学通报，2006，22（12）：401-402
[8] 宣慢．魔芋种质资源形态多样性与ISSR分析[D]．重庆：西南大学，2010
[9] 刘佩瑛．魔芋学．[M]．北京：中国农业出版社，2004．Liu Peiying．Konjac[M]．Beijing：Chinese Agriculture Press，2004（Ch）
[10] 杨朝柱，潘娅妮，谢玲玲，等．魔芋DNA快速微量提取及其ISSR-PCR 扩增[J]．基因组学与应用生物学，2009，28（3）：529-534
摘自：2013年武汉大学学报第1期第59卷
关键词:魔芋属；ISSR；遗传多样性；云南省
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