魔芋中魔芋葡甘聚糖的提取纯化及其含量测定影响因素的分析

刘艳华  马妍妮  陈  宏

（宁夏医科大学药学院药剂学系  宁夏银川  750004）

摘  要：目的 提取纯化魔芋精粉，并测定其多糖含量，以制得纯度高、质量好的魔芋葡甘聚糖。方法 采用改进的乙醇-丙酮混合沉淀法提取纯化魔芋精粉，结合酸水解-显色法和紫外分光光度法测定魔芋葡甘聚糖的含量。考察显色时间、水解温度、3,5-二硝基水杨酸添加量等条件对魔芋葡甘聚糖含量测定的影响，建立最佳显色及含量测定方法。应用该方法，测定魔芋精粉和纯化后的魔芋精粉中魔芋葡甘聚糖的含量。结果 纯化后的魔芋精粉中魔芋葡甘聚糖的含量高达90%以上。结论 采用改进的乙醇-丙酮混合沉淀法可制得纯度高的魔芋葡甘聚糖。

关键词：魔芋；魔芋葡甘聚糖；纯化；含量测定

中图分类号：R927.2   文献标识码：A    文章编号：1674-6309（2012）11-1133-03

魔芋为天南星科魔芋属多年生宿根性草本植物，是我国特有、高产植物资源。魔芋块茎中含有64.78％ 的魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucomannan，KGM），以及淀粉、蛋白质、纤维素等^[1]。KGM广泛应用于化工、食品、医药和生物材料开发等领域，其纯度直接决定了产品的质量和应用领域。例如，KGM作为生产药物微胶囊的材料时，纯度变化不仅可以改变胶囊的溶解速率，还会对包裹药物的疗效产生影响^[2]。因此，建立制备高纯度KGM的方法显得尤为关键。本文采用改进的乙醇-丙酮混合沉淀法，对魔芋精粉进行纯化，并采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）显色-紫外分光光度法测定KGM 的含量。

1  仪器与试药

WFO-700W送风定温干燥箱（上海爱郎仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HH-SY11-NI2-C电热恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）；UV-2550紫外-可见分光光度仪（日本Shimadzu公司）；TDL-5-A低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

魔芋精粉（武汉合中制药有限公司）；葡萄糖标准品（中国药品生物制品检定所）；酒石酸钾钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）；3,5-二硝基水杨酸（天津市百世化工有限公司）；重蒸苯酚（北京索莱宝科技有限公司）；亚硫酸钠（天津市福晨化学试剂厂）。

2  方法与结果

2.1  魔芋葡甘聚糖的提取纯化

将魔芋精粉以80％乙醇沸腾回流15min（每1g原料用乙醇15mL），趁热过滤，滤液减压回收乙醇；滤渣依次用95％乙醇、丙酮、乙醚洗涤，滤纸带滤渣自然挥干后，收集滤渣。

将前述滤渣以纯化水配置成0.1％的溶液，摇匀放置过夜使滤渣充分水化、溶散，中速磁力搅拌30min后，1500r·min离心15min，收集上清液，加入2倍量冷丙酮沉淀，边加边快速搅拌，过滤，滤液减压回收丙酮；滤纸带滤渣置烘箱中低温烘干后，收集滤渣。

上述滤渣分散在80℃热纯化水中使之完全溶解，溶液6000r·min离心90min，收集上清液；加入2倍量95％乙醇沉淀，边加边快速搅拌，过滤，滤液减压回收乙醇；滤渣依次用95％乙醇、丙酮洗涤，滤纸带滤渣置烘箱中低温烘干后，收集滤渣，研磨成粉、装袋密封，保存在干燥器中备用 。

2.2  魔芋葡甘聚糖的含量测定方法

采用酸水解-DNS显色法结合紫外分光光度法测定魔芋精粉和纯化后的魔芋精粉中KGM 的含量。

精密称定魔芋精粉0.1012g和KGM0.1032g，置于100mL烧杯中，各加入6mol·L^-1HC1溶液10mL和蒸馏水15mL，混匀，在沸水中密封水解30min后冷却，各加入酚酞指示剂2滴，用10％NaOH溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容至100mL，作为供试品和对照品溶液。

分别量取供试品和对照品溶液各1.0mL，加入25mL比色管中，加水使各比色管中液体的总体积为2.5mL，再分别精密加入DNS试剂3.0mL，混匀，于100℃沸水浴中煮沸10min后冷却至室温，加水至刻度，摇匀，用相应的试剂作空白，于KGM的最大吸收波长490nm处测定其吸收度，计算KGM含量 。

2.3  酸水解-DNS显色法影响因素的考察

2.3.1  显色时间

精密量取供试品溶液各1.0mL，分别加入到9支比色管中，再分别加入3.0mL DNS，在沸水浴上水解2、4、6、8、9、10、11、12、14min，490nm处测定其吸光度值，见图1。结果表明，DNS与还原糖反应的显色时间在9min后吸光度值变化不大，综合考虑选择10min为显色时间。

2.3.2  水解温度

精密量取供试品溶液各1.0mL，分别加入到5支比色管中，再分别加入3.0mL DNS，在30、50、70、90、100℃的水浴中显色10min，490nm处测定其吸光度值，见图2。结果表明，DNS与还原糖反应的显色温度在90℃和沸水浴时吸光值都较高且相差不大，综合考虑选择沸水浴为反应温度。

2.3.3  DNS添加量

精密量取供试品溶液各1.0mL，加入到9支比色管中，各加入0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5mL的DNS，在沸水浴上显色10min，490nm处测定其吸光度值，见图3。结果表明，DNS添加量为3mL时显色反应完全。

2.3.4  KGM水解酸度

精密量取供试品溶液各1.0mL，分别加入6支比色管，各加入2、4、6、7、8、10 mol·L 的溶液10mL，沸水浴中显色10min，490nm处测定其吸光度值，见图4。结果表明，HCI的浓度为6 moL·L 时魔芋中KGM可水解完全。

2.3.5  KGM水解时间

精密量取供试品溶液1.0mL，分别加入6支比色管，再加入6mol·L 的HC1溶液10mL。分别在沸水浴中水解l5、20、30、45、60、90min，在490nm处测定吸光度，见图5。结果表明，沸水浴中水解30min时KGM即可完全水解。

2.4  KGM含量的测定

精密量取魔芋精粉和纯化后的KGM精品样品溶液0.8mL于比色管中，其余操作按优化后的酸解-DNS显色方法操作，测定吸光度值，每个样品平行测定5次。依照下式计算样品中KGM的含量：

KGM含量（％）=（a×c×100）／W×100

其中a=0.9，为单糖折算成KGM的换算系数；c为平均吸光值对应的KGM毫克数；W为魔芋精粉或KGM精品的样重（mg）；100为稀释倍数。

表1为魔芋原料和经纯化的魔芋中KGM的含量，结果表明采用改良的沉淀法对魔芋精粉进行纯化、除杂后，魔芋中KGM的含量由64.4％提高到93.8％。

3  讨论

3.1  KGM纯化方法

多糖纯化方法的选择对其结构、理化性质乃至生物活性都有很大的影响，采用温和条件、低极性溶剂处理有利于保持其水溶性、流变性、凝胶性等理化性质，也利于保持分子结构。另外，纯化方法也对产品回收率和纯度有较大影响。文献已报道的乙醇沉淀法均采用水溶性的胶体纯化处理，干燥后较难恢复成颗粒状，黏度有所降低。若不采用水溶胶，则很难打开分子链，里面的杂质很难被除去，得不到高纯度的KGM^[5-6]。本文对文献报道的沉淀法进行改良，采用乙醇-丙酮合用，沉淀并纯化多糖，可有效提高多糖纯化率。研究表明，纯化后魔芋精粉中KGM含量由64.4％提高到93.8％，说明本试验的纯化方法效果好且结果可靠。

3.2  KGM含量测定方法

目前，KGM含量测定方法有斐林试剂滴定法、重量法、DNS比色-分光光度法、旋转黏度法和高效液相色谱法等。DNS比色法是测定KGM含量较为理想的方法之一。该方法简单、准确且重复性好。但从文献报道看，利用该法测定KGM含量时，其最大吸收波长各异。本实验选用490nm为最大吸收波长，测定KGM的含量，测定结果精密度高，重现性好，为今后采用DNS比色-紫外分光光度法钡 定KGM含量提供了理论依据^[7-8]。

用DNS法测定KGM含量时，需先将样品经酸彻底水解后，产生具有还原性的两种单糖-葡萄糖和甘露糖，再通过DNS与还原糖的呈色反应，用紫外分光光度法测定样品中总还原糖，再换算成KGM的含量^[9]。因此，KGM是否完全水解成单糖是确保测定结果准确的一个重要步骤。水解温度、酸度和时间是控制水解程度的重要因素。通过试验我们确定了最适宜的水解温度、酸度和时间，回收率试验表明，该法测定结果准确可靠。

采用改良的乙醇-丙酮混合沉淀法对魔芋精粉进行纯化、除杂，建立了结合酸水解-DNS显色和紫外分光光度法测定KGM含量，并优化了酸水解-DNS显色条件。纯化后的魔芋产品中KGM含量高达90％以上。乙醇-丙酮混合沉淀法是获得高纯度KGM的有效方法。

参考文献：

[1] 韩宝瑞，安刚．魔芋的资源概况与应用研究[J]．国际老年医学杂志，2010，31（2）：87

[2] 刘楠，杨芳．魔芋葡甘聚糖的研究进展及应用现状综述[J]．安徽学院学报，2011，23（4）：95

[3] 彭香莲，付红军，李忠海，等．乙醇提取魔芋葡甘聚糖的研究[J]．食品科技，2010，35（5）：248

[4] 马东萍，刘维涓，卫青，等．3,5-二硝基水杨酸显色法测定烟草中的果胶[J]．烟草科技，2006，8：38

[5] 胡敏，李波，龙萌，等．魔芋葡甘聚糖的提纯及应用[J]．内蒙古科技与经济，2009，1（17）：31

[6] 唐贵丹，杜小兵，张兴国，等．酸性乙醇法纯化魔芋葡甘聚糖的研究[J]． 食品科技，2008，29（12）：308

[7] 阎华，沈秀荣．魔芋葡甘聚糖测定方法的比较研究[J]．食品研究与开发，2009，30（2）：111

[8] 喻玲玲，邹坤．鄂产魔芋中葡甘聚糖的含量测定[J]．时珍国医国药，2008，19（3）：680

[9] 何鑫磊，温成荣，陈清萍．酸法纯化魔芋多糖的探讨[J]．广西热带农业，2008，1：3

摘自：宁夏医科大学学报2012年11月第34卷11期